Принцип работы спектрофотометра: правила измерения прибором и сущность метода

Спектрофотометрический метод анализа

Молекулы, имеющие одинаковую связь и образующие группу в области ПЧ, дают полосы поглощения соответствующей характеристической частоты. Эти характеристические частоты помогают определить наличие нужных групп атомов или молекул в исследуемой суспензии по полученному спектру.

Спектрофотометрию делят: на молекулярную, когда искомое вещество имеет молекулярное строение, и атомную. В зависимости от длин волн, которые способен различать прибор, и веществ, которые необходимо будет определить, выбираются спектрофотометры.

Для коррекции законов преломления и дисперсии в некоторых приборах измеряют суспензию (раствор с исследуемым веществом) и раствор. Когда пучок света проходит через суспензию, то в зависимости от поглощающих свойств вещества он ослабевает. Интенсивность ослабления луча зависит от содержания вещества во взвеси. Более точную зависимость определяет закон Бугера-Ламберта-Бера (БЛБ), закон «вещества от его толщины, от ослабления энергетической линии».

Спектрофотометрическое определение появляется во многих областях для разных задач:

• подтверждает подлинность заявленного товара/товара,
• определяет качество производимого препарата,
• использовать его для поиска радиоактивных элементов в водоемах,
• количественно определяет, сколько различных веществ находится во взвешенном состоянии,
• различать химические элементы во взвешенном состоянии.

Применяется в биологических и геологических лабораториях, в целях радиологической безопасности (на атомных станциях, в институтах и ​​др.), производствах, где требуется знать химический состав продуктов и материалов.

Основания оптической спектрофотометрии

Спектрофотометрия основана на способности химических соединений и отдельных атомов взаимодействовать с электромагнитными волнами. Взаимодействие молекул исследуемых веществ с излучением в УФ, видимой и ИК частях спектра приводит к построению прибором зависимостей, называемых спектрограммами (рис. 1, 2). Спектрограмма образца позволяет судить о его составе как в количественном, так и в качественном отношении.

Законы поглощения света

При прохождении луча света или другого излучения через жидкость или при попадании этого луча на твердую поверхность часть энергии луча расходуется на различные процессы: ионизацию, нагрев вещества, вторичное излучение (фотолюминесценцию) и ряд других. Различные вещества вызывают снижение энергии излучения различными механизмами и их комбинациями. Этот процесс описывается законом Бугера-Ламберта, отвечающим за качественную сторону спектрофотометрического анализа и имеющим следующую формулировку: «Относительное количество света, поглощаемого пропускающей средой, не зависит от интенсивности исходного излучения. Каждый слой одинаковой толщины поглощает часть прошедшего монохроматического излучения».

Математически этот закон выражается следующим образом: I = I0 * 10-кл, где I0 — интенсивность исходного падающего излучения, I — интенсивность потока излучения, прошедшего через вещество, l — толщина слоя поглотителя из вещества, k – коэффициент поглощения, соответствующий обратной величине поглощающего слоя, необходимой для ослабления прошедшего излучения в 10 раз.

Разные свойства материалов приводят к разной степени участия соседних атомов и молекул в описываемых процессах, поэтому одноатомные газы и пары металлов характеризуются низким коэффициентом поглощения. Для металлов, наоборот, значение коэффициента поглощения будет большим, так как попадание излучения на металл приводит к его взаимодействию с электронами, свободно перемещающимися между узлами атомной решетки вещества. Закон Бера формулируется так: «поглощение потока излучения прямо пропорционально числу частиц поглощающего вещества, через которые проходит данный поток излучения». Выражаясь математически, он принимает вид: k = ε * c, где ε — коэффициент пропорциональности.

В основе спектрофотометрического метода анализа лежат законы Бугера — Ламберта и Бера. Считается, что если испытуемый образец содержит несколько веществ и эти вещества не взаимодействуют, то их оптические плотности складываются. Это утверждение называется законом аддитивности. Эти зависимости более подробно описаны в соответствующей литературе, так как существует множество нюансов и тонкостей при работе со спектрофотометрическими методами анализа.

Видимый, инфракрасный и УФ спектры

Ультрафиолетовая, видимая и инфракрасная части спектра — тривиальные названия излучения, длина волны которого попадает в соответствующие области:

• 10-400нм — ультрафиолет;
• 450-760нм — видимый свет;
• 780-1500 нм — инфракрасное излучение.

Электромагнитное излучение с разными длинами волн сообщает облучаемому веществу разное количество энергии. Именно передача энергии образцам лежит в основе методов спектрофотометрического анализа. Способность различных длин волн света возбуждать различные атомы приводит к возможности качественного анализа образцов.

Качественный и количественный анализ вещества

Так как пучок излучения, испускаемый спектрофотометром, взаимодействует как непосредственно с атомами, так и со связями в молекулах веществ. Каждое вещество имеет свой характерный спектр поглощения. По совокупности спектров поглощения в образце можно судить о наличии тех или иных веществ в анализируемом образце. Это называется качественным анализом, потому что он указывает только на присутствие определенных соединений, но не на их количество.

Количественный анализ использует установленный Бэром закон, гласящий, что существует прямая зависимость между числом частиц поглощающего вещества и поглощением потока излучения. По уменьшению интенсивности этого излучения можно судить о количестве частиц в поглощающем веществе и затем использовать эти знания для расчета количества вещества. Число Авогадро часто используется для расчета концентрации по количеству частиц.

Единицы измерения и формулы соединений

Достаточно информативны спектрограммы, полученные при различных видах спектроскопических исследований. Различные типы органических связей, присутствующие в веществах, приводят к появлению так называемых «пиков». Величина этих пиков, выраженная в интенсивности поглощения Т, а также их расположение на оси, соответствующей разным волновым числам в см-1, позволяют точно судить о составе исследуемого образца. Так, на рис. 1 два острых пика, расположенных в области 500-1000 см-1, свидетельствуют о наличии в веществе связи С-Cl, а пики в области ~3000 см-1 указывают на наличие валентных колебаний связи CH. Для интерпретации спектров используются специальные таблицы характеристических частот поглощения.

Отличие метода спектрофотометрии от флуориметрии

Кажущееся сходство между флуориметрическим и спектрофотометрическим методами анализа вводит в заблуждение. Различия между этими методами лежат глубоко в физике изучаемых при анализе процессов. Кроме того, явление флуоресценции, лежащее в основе соответствующего метода, может быть одним из процессов, происходящих в изучаемом спектрофотометрически веществе. Флуорометрический метод анализа основан на способности некоторых веществ флуоресцировать при облучении монохроматическим светом; это удивительная особенность взаимодействия одного соединения с излучением. С другой стороны, спектрофотометрия использует почти весь список доступных взаимодействий между веществом и излучением и поэтому является более широко применимым методом анализа.

Математическое описание спектрофотометрического метода

Введем понятие коэффициента передачи Т.

I – интенсивность световой энергии, проходящей через суспензию,

I0 — через раствор.

Для определения концентрации искомых веществ в спектрофотометрах используется оптическая плотность, которая находится как D = -log10(T).

Концентрация находится количественно по закону БЛБ:

I=I0*10-εлк

С помощью элементарных преобразований легко получить, что log10(T)=ε*l*c или D= ε*l*c.

Обозначения переменных представлены ниже в ограничениях этого закона.

Если в решение введено несколько тестовых заданий, то метод применим и в этом случае. Каждый элемент будет вносить вклад в общую оптическую плотность по закону сложения:

Д=Д1+Д2+…+Дк.

Закон Бугера Ламберта Бера определяет, что оптическая плотность линейно связана с концентрацией, и ее график выходит за начало координат. В действительности линейность соблюдается не всегда.

Закон Бугера Ламберта Бера

Для полного исполнения закона необходимо соблюдение следующих условий:

1. Излучение должно быть монохроматическим, то есть длина волны должна быть одинаковой, оно будет светить через раствор и суспензию.
2. Молярный коэффициент поглощения (ε) зависит от преломляющих свойств среды, как суспензии, так и раствора. Если преломление во взвеси сильнее, то линейный закон не действует. Чем больше коэффициент ε, тем более чувствительным будет метод в этом определении.
3. Во время измерений температура окружающей среды должна быть постоянной. Изменение всего на пару градусов.
4. Должен использоваться только параллельный световой пучок.
5. При измерении спектрофотометром концентрация (с) аналита не должна меняться из-за изменения природы аналита. Например, в суспензии молекулы не должны превращаться в ионы в результате диссоциации или кислотно-щелочной реакции.
6. Старайтесь избегать возбуждения электронов в атоме (иногда этот метод используют и для анализа, но в классическом применении его избегают), т е не облучайте атомы энергиями более шестидесяти килоджоулей.
7. Свет должен проходить один и тот же путь (l) при измерении раствора и суспензии.
8. В качестве раствора часто используют дистиллированную воду.

Ограничения спектрофотометрического метода

1. 
   Те энергии (длины волны), которые соответствуют уровням энергии возбуждения внутренних переходов атомов и молекул, поглощаются более интенсивно: тогда молярный коэффициент поглощения максимален.
2. Метод плохо работает для газовой смеси.
3. Ограничения закона BLB.

ГОСТы для спектрофотометрии

Спектрофотометрия упоминается в большом количестве ГОСТ. Поэтому ГОСТ Р 58399-2019 устанавливает стандарт на методы неразрушающего контроля, в том числе на спектрофотометрию. ГОСТ 8.557-2007 устанавливает правила поверки приборов для измерения приведенных спектральных, интегральных и направленных коэффициентов пропускания и оптической плотности. ГОСТ Р 8.657-2009 устанавливает метод поверки инфракрасных спектрометров.

Техническая часть спектрофотометрического метода

Спектрофотометрические исследования требовательны при приготовлении растворов, как окрашенных, так и чистых. Для измерения спектров используют спектрофотометр и фотоколориметр, в которые помещают исследуемые растворы.

Основные части спектрофотометра:

1. источник излучения,
2. монохроматор (если источник света не может давать монохроматический луч),
3. кювета, в которую помещают растворы и суспензии,
4. измерительный прибор.

Основные части расширены: 1 с призмами, зеркалами и линзами для достижения параллельного света, 2 клинья и диафрагмы, уравнивающие интенсивность световых лучей.

Вы можете добиться монохромного света со следующими источниками света:

• непрямой солнечный свет,
• галогенные лампы,
• быть,
• нернст пин,
• лампа накаливания,
• общий штифт,
• флуоресцентный свет.

Спектрофотометрическое измерение, как описано выше, требует выбора желаемой оптической линии. Для изготовления штифта Нернста (шН) используются оксиды редкоземельных элементов Ме, которые плотно запрессовываются в колонку. Глобар (G) получают прессованием карбида кремния в колонне. При прохождении через них тока они испускают световое излучение с соответствующими длинами волн: wN — от 1,6 до 2,0 мкм или от 5,6 до 6,0 мкм; Д — от 2 до 16 мкм.

Монохроматоры — это те устройства, которые создают стабильную волну. В качестве наполнителей для монохроматоров используются светофильтры и призмы.

Фильтры делятся на:

1. Поглощение
2. Помехи
3. Интерференционная поляризация

Для изготовления светофильтров и кювет наиболее часто используют кварц и стекло.

Фотоумножители и фотоэлементы используются в качестве рецепторов интенсивности световых лучей или рецепторов. Приемники характеризуются двумя свойствами: спектральной и интегральной чувствительностью. Первая характеристика — способность различать разные оптические линии, интегральная чувствительность — способность реагировать на непрерывный поток света.

Для измерений в ИК-диапазоне излучения используются термоэлементы, которые изготавливаются из термоЭДС или термопар, и болометр. Последний изменяет сопротивление материала при воздействии температуры: термоэлемент включается в цепь моста, инфракрасное излучение вызывает нагрев этого элемента и разбалансировку моста.

Спектрофотометрический анализ включает в себя построение градуировочного признака по известным образцам для получения зависимости C=f(D), сопоставление полученных результатов в дальнейшем. При определении градуировочной характеристики порядок измерения следующий: 1 раствор (является основой для измерений) — его измерение, 2 добавление в раствор испытуемого вещества, 3 добавление красителя. При этом степень окраски суспензии должна прямо зависеть от концентрации испытуемого вещества, 4 измеряемой на спектрофотометре окрашенного раствора. Иногда в спектрофотометр вводят соответствующие основания, и тогда метод не требует градуировочных образцов.

Особенности спектрофотометров

Первые фотометры требовали участия медицинского работника для проведения исследования. Специалист должен был сравнить и записать показатели, полученные от прибора. Данные сравнивались с общепринятыми стандартами. На смену этим приборам пришли автоматические фотоэлектрические колориметры.

Спектрофотометры — современное медицинское оборудование, предназначенное для изучения и анализа свойств объектов или веществ с помощью электромагнитного излучения. Световые лучи проходят через образец или отражаются от него. Прибор сравнивает световой поток, изначально направленный на биоматериал, с излучением, прошедшим через образец или отраженным от его поверхности.

Содержание:

• Характеристики спектрофотометров
• Приложения
• Как устроено устройство?
• Особенности устройства
• Правила выбора спектрофотометра

Для анализа сканируется широкий диапазон волн: от 160 нм (ультрафиолетовый) до 3300 нм (инфракрасный), с помощью которых получают наиболее точную информацию о веществе.

Спектрофотометрический метод основан на том, что каждый объект имеет особые спектральные характеристики. Именно поэтому при анализе температурный режим и агрегатное состояние образца не играют никакой роли. Особенностью спектрофотометра является возможность проведения качественных и количественных исследований.

Основным преимуществом фотоэлектрического фотометра является вывод полученной информации на экран (лаборант может видеть состав пробы, наличие и количество примесей). С помощью специальных светофильтров прибор определяет в пробе не менее 3-5 составляющих компонентов.

Принцип работы и схема прибора

Спектрофотометры имеют множество вариантов конструкции. В современном мире ИК-спектрометры часто используют технологию частичного инфракрасного излучения для получения информации о составе образцов. Принципиальная схема такого устройства показана на рис. 4. Принцип действия указанного устройства заключается в измерении степени поглощения инфракрасного излучения образцом, расположенным между источником излучения и детектором. При этом стоит отметить, что современные фурье-спектрометры используют сложную оптическую систему (интерферометр Майкельсона), которая разделяет потоки излучения и с помощью этого создает интерференционную картину. Подвижное зеркало позволяет создать необходимую для исследования разность хода лучей, что приводит к сложной картине — интерферограмме.

Приборы, работающие в видимой и ультрафиолетовой частях спектра, имеют несколько иной принцип работы. Существуют две основные схемы таких устройств с разным расположением монохроматора. Эти схемы показаны на рис. 5 и рисунок. 6. Принцип его действия заключается в сравнении отраженного пучка излучения испытуемого образца и эталонного образца, оптическое поглощение которого считается равным нулю. По разнице интенсивности пучка излучения можно судить об оптической плотности испытуемого вещества, а затем по закону Бугера-Ламберта-Бера установить концентрацию испытуемого вещества. В этом случае за качественное определение отвечает длина волны, при которой поглощается свет.

Оценка чувствительности аппаратов

Спектрофотометры обладают достаточно высокой чувствительностью. Из-за особенностей и требований метода анализа спектрофотометры часто настраиваются по-разному для разных тестов, поэтому их чувствительность сильно не меняется. Основными параметрами этих оптических приборов являются полоса пропускания, аппаратная функция конфигурации и разрешение конфигурации. Аппаратная функция показывает лишь степень отклонения, вносимого в измерения самим прибором, когда и разрешение, и полоса пропускания могут изменяться и зависеть от параметров монохроматора, источника излучения и их комбинации.

Особенности работы устройства

Спектрофотометрический метод основан на измерении степени отражения или поглощения монохроматических световых лучей. Во время исследования посторонние факторы не могут повлиять на эффективность анализа. Все устройства работают по двум типам цепей. В первом случае на образец падает монохроматический пучок света с определенной длиной волны, который после прохождения образца направляется на фотоприемник, измеряющий разность потоков.

Суть второй схемы заключается в том, что реагент получает поток света непосредственно от лампы, затем монохроматор выделяет небольшой пучок и направляет его на фотоприемник.

Спектрофотометры бывают однолучевые и двухлучевые. В приборах с одним лучом для измерения применяются поправочные коэффициенты. В случае двухлучевой диагностики один луч падает на образец, а второй – на эталонное значение. Двухлучевое оборудование является более точным, информативным и менее чувствительным к факторам окружающей среды.

Основное содержание месяца

• Коронавирус: SARS-CoV-2 (COVID-19)
• Антибиотики для профилактики и лечения COVID-19: насколько они эффективны
• Самые распространенные «офисные» болезни
• Убивает ли водка коронавирус
• Как остаться в живых на наших дорогах?

Типы спектрофотометров

1. однолучевой;
2. два луча;

Существует однолучевой спектрофотометр и двухлучевой спектрофотометр. Двухлучевой спектрофотометр сравнивает интенсивность света между двумя световыми путями, а однолучевой спектрофотометр измеряет интенсивность света до и после каждого образца. Двухлучевой спектрофотометр измеряет коэффициент отражения различных жидких растворов и испытуемых образцов, прежде чем выводить точные значения на цифровой дисплей. Однако эти значения варьируются от 20 до 2500 нанометров.

Правила выбора спектрофотометра

При выборе устройства необходимо учитывать сферу его применения и выполняемые задачи. Фотоэлектрические фотометры бывают переносными и стационарными. Портативные устройства легкие, компактные и простые в использовании. Стационарные аппараты устанавливаются в медицинских учреждениях и диагностических центрах. С помощью этих приборов производятся более сложные измерения. Такие спектрофотометры могут быть подключены кабелем к персональному компьютеру, а полученные данные подлежат подшивке, обработке и печати на принтере.

При выборе медицинского изделия следует учитывать: спектр действия (диапазон действия); длина волны; универсальность устройства; Габаритные размеры; цена; вероятность проведения определенных исследований; количество секций для реагентов; способ получить результат. Также необходимо обратить внимание на стандартную комплектацию модели спектрометра, так как почти все современные приборы продаются с кюветой и чашкой Петри.

Как использовать спектрофотометры?

Чтобы использовать спектрофотометр, очистите кювету. Важно надевать перчатки, так как отпечатки пальцев или грязь могут исказить результаты. Затем добавьте раствор и установите спектрофотометр на предпочтительную длину волны. Поместите пустую кювету внутрь прибора и нажмите кнопку «установка нуля», чтобы откалибровать прибор на нужную длину волны. Добавьте раствор для расчета поглощающей способности.

Принцип действия

Работа спектрофотометра основана на принципе измерения отношения двух световых потоков: потока, проходящего через испытуемый образец, и потока, падающего на испытуемый образец (или проходящего через испытуемый образец).

Структурная схема спектрофотометра представлена ​​на рис. 4

Световой пучок от осветителя попадает в монохроматор через входную щель и разбивается на спектр дифракционной решеткой. Контрольные и тестовые образцы поочередно вводят в поток монохроматического излучения через выходную щель в кюветном отсеке. Излучение, прошедшее через образец, попадает на катод фотоэлемента приемно-усилительного блока. Электрический ток, проходящий через резистор RH, включенный в анодную цепь фотоэлемента, создает на резисторе падение напряжения, пропорциональное потоку излучения, падающего на фотокатод.

Усилитель постоянного тока с коэффициентом усиления, близким к единице, обеспечивает передачу сигналов на вход микропроцессорной системы (далее — МПС), МПС по команде оператора поочередно измеряет и запоминает напряжения UT и U, пропорциональные темновой поток от фотоэлемента, поток, проходящий через контрольный образец, и поток, проходящий через тестовый образец. После измерения MPS рассчитывает коэффициент пропускания T испытуемого образца по формуле

У-УТ

Т= ¾¾¾ *100 (1)

U0-UT

Значение измеряемой величины отображается на цифровом фотометрическом дисплее

Включение спектрофотометра

Закройте фотоэлемент, установите рукоятку переключателя жалюзи 49 в положение ЗАКРЫТО, отрегулируйте ширину щели на 0,15 нм переключателем 21.

Клавиатура МПС, после которой в номеронабирателе МПС должна стоять запятая.

При установке рычага 34 в положение H лампа накаливания включается сразу после нажатия кнопки POWER; когда этот рычаг находится в положении D, дейтериевая лампа включается автоматически через одну минуту нагрева.

Стабильная работа спектрофотометра гарантируется через 30 мин после включения питания.

Выключите спектрофотометр, нажав кнопку POWER.

Стабильная работа дейтериевой лампы гарантируется через 30 минут после включения питания.

Порядок работы

Подготовка к измерению

Включите спектрофотометр

Устанавливают в держатель от одного до трех испытуемых образцов, контрольный образец можно установить в четвертую позицию держателя. Поместите переноску на тележку в отделение для кювет.

Установите требуемую длину волны, поворачивая ручку длины волны в сторону увеличения длины волны. Если при этом масштаб изменится на значение больше необходимого, то необходимо вернуть его от 5 до 10 нм и привести обратно к требуемому делению.

Рукояткой 41 и рычагом 34 установите фотоэлемент и источник излучения в рабочее положение, соответствующее выбранному спектральному диапазону измерения.

Перед каждым новым измерением, когда значение выходного напряжения неизвестно, следует установить ширину щели на 0,15 нм, чтобы избежать засветки фотоэлементов.

Показания следует снимать при плотно закрытой крышке кюветного отсека.

Открывайте крышку отсека для проб только в том случае, если рукоятка переключателя заслонки находится в положении ЗАКРЫТО.

Измерение оптической плотности

Установите ручку 49 в положение ЗАКРЫТО.

Подключить вольтметр.

Установите значение ручки 50 ZERO на вольтметре равным нулю.

Поместите контрольный образец на пути потока излучения в положение 1, переместив каретку с рукояткой 40. При отсутствии контрольного образца измерение будет производиться относительно воздуха (I0). Поставьте кювету с тест-раствором в положение 4.

Установите ручку 49 в положение ОТКРЫТО.

Установите ручку SLOT в положение 2.5.

Устанавливают измеряемые образцы один за другим на пути потока излучения, перемещая каретку с рукояткой 40. Снимают показания вольтметра (в положении 1 — I0, в положении 4 — I).

Выполнить операции, указанные в п.п. 2,1 – 2,7 с шагом 10 нм от 550 до 800 нм.

Выполнить операции, указанные в п.п. 2.1 — 2.8 для всех доступных решений.

2.10. Постройте поглощение (D) в зависимости от длины волны (l).

Определение концентрации

Определение концентрации испытуемого раствора на спектрофотометре возможно при линейной зависимости оптической плотности D испытуемого раствора от концентрации С.

Измерения следует проводить при длине волны 650 нм.

Установите ручку 49, чтобы переместить штору в положение ЗАКРЫТО.

Установите кювету с испытуемым раствором и кювету с растворителем в отделение для кювет.

Поверните ручку изменения длины волны, чтобы установить желаемое значение (650 нм).

Установите ручку ZERO на вольтметре на значение, равное 0. Установите ручку SLOT в положение 2,25.

Установите ручку 49 в положение ОТКРЫТО. Снимите показания вольтметра для I и I0 .

Запускать страницы 3.1 — 3.5 для всех доступных решений.

Постройте калибровочный график зависимости оптической плотности (D) от концентрации (C). Постройте калибровочный график следующим образом:

Готовят серию растворов данного вещества с известными концентрациями, охватывая диапазон возможных изменений концентрации этого вещества в испытуемом растворе. Определить оптическую плотность всех растворов и построить градуировочный график, отложив известные концентрации по оси абсцисс, а соответствующие значения оптической плотности по оси ординат.

Сферы применения

Спектрофотометры применяются для исследований в биохимии (анализируются липиды, электролиты, субстраты, ферменты), иммунохимии (анализируются лямбда, ферритин, миоглобин, микроальбумин, гаптоглобин), бактериологии. Фотоэлектрический колориметр используется для анализа качества пищевых продуктов и воды (остаточной, природной и питьевой). При определении качественных характеристик воды определяют мутность и цвет жидкости, наличие тяжелых металлов и поверхностно-активных компонентов, содержание нитритов, фосфатов, фенолов и сульфатов.

Спектрофотометр полезен для научных, гормональных, экологических и специальных исследований. В подразделениях санитарно-эпидемиологического надзора наличие этого прибора обязательно. Помимо медицины оборудование используется в сельском хозяйстве и промышленности.

Фотоэлектрический фотометр необходим для:

• определить чистоту исследуемых образцов и найти примеси;
• измерения в жидкостях оптической плотности и ее изменений;
• определить концентрацию пробы (исследование проводится в медицинских учреждениях);
• исследование, анализ состава и химического строения веществ, проб и реагентов;
• спектральная диагностика.

Фотоэлектрический колориметр – это прибор, используемый для проведения различных исследований: медицинских; биологический; фармацевт; хим. Благодаря точным результатам, которые появляются на экране оборудования, врач может узнать характеристики реагентов и назначить пациенту эффективное лечение.

Медицина и фармацевтика

Высокая чувствительность приборов к присутствию посторонних веществ, а также возможность определения того, что в исследуемом образце происходят химические реакции, обусловили использование спектрофотометров в медицинских и фармацевтических целях. Для многих препаратов известны их спектры поглощения, поэтому процесс проверки чистоты образцов сводится к сравнению спектрограмм, полученных в ходе исследования, что позволяет ускорить процесс контроля качества и сделать его более точным. Кроме того, чувствительность прибора позволяет тестировать множество образцов на предмет непрерывных изменений в них, что находит свое применение в ряде медицинских тестов.

Анализ пищи и питьевой воды

Как и в медицине, высокая чувствительность приборов позволяет установить наличие небольшого количества примесей в исследуемых образцах, что положительно сказывается на качестве и скорости анализа. Особенно ценна способность спектрофотометров обнаруживать примеси тяжелых металлов в анализируемых образцах.

Изучение неизвестных веществ

Исследование неизвестных веществ с помощью спектрофотометрии позволяет с высокой точностью определить состав исследуемого образца. ИК-спектроскопия — важный и часто используемый аналитический метод при синтезе новых веществ, необходимый для качественной и количественной характеристики продуктов синтеза.

Металлургия и химпроизводство

Возможность спектрофотометров работать с твердыми и жидкими образцами делает эти приборы незаменимыми в металлургической и химической промышленности. Спектрофотометрия является одним из основных неразрушающих методов определения состава сплавов и его контроля. Он также широко используется в нефтехимической промышленности для проверки чистоты сточных вод.

Полиграфия, печать цветной графики

Поскольку спектрофотометры используют монохроматический свет, они используются в цветной печати и графике. Приборы позволяют определять цвета с высокой точностью и используются для точечного и автоматического анализа, результаты которого необходимы для создания максимально точных профилей производительности печатного оборудования в соответствии со стандартами ICC, Международного консорциума по цвету. ICC была основана в 1993 году лидерами отрасли, включая Apple, Agfa, Adobe, Kodak, Microsoft, Silicon Graphics, Sun Microsystems и Taligent.

Определение состава сточных и природных вод

Повышенная чувствительность метода позволяет определять даже малые следовые количества многих веществ. В работах, связанных с анализом сточных и природных вод, это свойство спектрофотометров делает приборы незаменимыми для обнаружения наиболее опасных примесей. Примером очень опасных примесей являются металлоорганические соединения ртути. Именно этот класс веществ отвечает за появление у человека такого заболевания, как синдром Минамата. В 1956 году в японской префектуре Кумамото было обнаружено высокое содержание метилртути, нейротоксического яда, опасного даже в следовых количествах. Ее присутствие в воде было связано с выбросом в океан неорганической ртути и ее соединений, которые затем включались в метаболизм микроорганизмов.

Теоретически с помощью такого чувствительного и избирательного метода, как спектрофотометрия, можно обнаружить даже небольшое количество метилртути в пробах воды залива. Поэтому спектрофотометрия является важным методом анализа и оценки сточных вод.

Различие между сточными и природными водами

Сточные и природные воды отличаются друг от друга в основном составом примесей. Природные воды содержат различные органические соединения природного происхождения, а также бактерии и другие микроорганизмы. Сточные воды могут содержать искусственные органические соединения, как побочные продукты различных синтезов, а также нефтехимические отходы, микропластик и другие загрязнители. В этом смысле подход к анализу природных и остаточных вод различен, и каждый случай имеет свою специфику. Использование спектрофотометров для контроля состава промышленных сточных вод удобно, так как технологический процесс диктует состав загрязняющих веществ. Зная состав загрязнителей.

Этапы проведение спектрофотометрии стоков

Подготовка образцов исследуемой воды

Пробы воды для испытаний должны быть подготовлены в соответствии с используемым методом анализа (ИК, УФ или оптическая спектроскопия), а предполагаемые загрязнители должны быть выделены во время количественного анализа. Мутные воды часто не подходят для использования с кюветными спектрофотометрами, предназначенными для жидких проб, поэтому их отделяют от жидкой части пробы и анализируют отдельно соответствующими методами.

Подготовка кювет и пробирок

Специфика спектрофотометрического анализа диктует необходимость использования кювет из специальных оптических материалов, свободно пропускающих излучение на нужных исследователю длинах волн. Например, обычное кварцевое стекло блокирует УФ-излучение (поэтому невозможно загореть через окно) и поэтому не подходит в качестве материала для стеклянной посуды, используемой в УФ-спектрофотометрии.

Как и в случае с другой стеклянной посудой в аналитической химии, кюветы, пробирки и другая стеклянная посуда должны быть тщательно вымыты и высушены, чтобы они не мешали результатам анализа. С кюветами для оптических приборов обращаются бережно, исключая загрязнение отпечатками пальцев или сколами оптического материала, так как это также влияет на качество анализа.

Н4. Приготовление контрольного раствора

Контрольным раствором с точки зрения оптических методов анализа является раствор с известными оптическими характеристиками. Поскольку принцип работы спектрофотометра основан на изучении пропускания и поглощения света изучаемыми веществами, его можно описать количественно только в относительных единицах. Для установления такой зависимости готовят стандартный раствор заданной оптической плотности, который при исследовании доводят до нуля. Состав такого раствора зависит от условий, в которых будет работать спектрометр. Большинство современных приборов имеют встроенные эталоны, с которыми проводятся сравнения.

Титрование объектов

Указание волны света на монохроматоре

Длина волны излучения определяется монохроматором прибора. В современных спектрофотометрах в качестве монохроматоров используются дифракционные решетки, а также призматические устройства. Часто используемые приборы с двойным монохроматором: комбинация двух последовательно установленных монохроматоров. С помощью этой части прибора можно задать длину волны, с которой необходимо проводить исследование. Ранние монохроматоры, такие как монохроматор Черни-Тернера, могли вручную регулировать угол зеркала, одной из частей устройства, отвечающей за разделение света на определенную длину волны, но в большинстве современных инструментов используются зеркала с электронным управлением или наборы дифракционных решеток с требуемым сроком и другими характеристиками. Любопытно, Диски CD-R также являются своеобразной дифракционной решеткой, поскольку на их поверхности есть бороздки для записи информации. Именно эти канавки определяют способность таких дисков «сиять» в глазах наблюдателя. Период решетки диска CD-R составляет приблизительно 1,6 мкм.

Калибровка прибора

Калибровка прибора позволяет повысить точность измерений, а также убедиться в отсутствии нарушений в работе установки. Для обеспечения калибровки используются различные методики, но основными из них являются специальные фильтры с заданным поглощением или растворы таких веществ, как медный купорос или кобальт-аммонийный купорос. Шкала длин волн прибора проверяется с помощью стеклянных фильтров, содержащих смесь празеодима и неодима или гольмия. Все калибровочные работы необходимо проводить с использованием ртутно-кварцевых или водородных газоразрядных ламп. Частота калибровки напрямую зависит от режима использования прибора. Решение о проведении калибровки часто принимает руководство лаборатории.

Большинство современных спектрофотометров имеют предустановленные утилиты и встроенные компоненты, позволяющие выполнять калибровку одной кнопкой. В случае возникновения подозрений на недостоверность калибровочных измерений могут быть использованы услуги организаций, оказывающих техническую поддержку, в том числе поверку и калибровку лабораторного оборудования.

Измерение оптической плотности образца

После полной подготовки к анализу образец помещается в рабочую камеру прибора. Современные электронные спектрофотометры работают в полностью автоматическом режиме и требуют минимального контроля. Однако более старые модели требуют ручной настройки параметров прибора и расчета относительной оптической плотности образца по показаниям окуляра. После измерения оптической плотности на разных длинах волн строится графическая спектрограмма.

В случае использования ИК-спектроскопов процесс несколько иной. Используемые в настоящее время современные Фурье-спектрометры изначально строят интерферограмму, чтение которой невозможно без ее предварительной математической обработки. После преобразования Фурье интерферограммы исследователь получает готовые к интерпретации спектрограммы. ИК-анализ позволяет установить колебания отдельных связей в молекулах, обладая при этом исключительной точностью, а также позволяет определить количество примесей по активности пиков в областях, соответствующих определенным связям.

Однако сильно загрязненные образцы могут вызвать трудности при чтении спектрограммы, так как наличие слабых, но заметных флуктуаций на участках, не характерных для исследуемого вещества, может сбить исследователя с толку. Если состав примесей неизвестен, исследователю может быть представлена ​​так называемая «зашумленная» спектрограмма с большим количеством противоречивых пиков и сигналов от различных функциональных групп различных органических веществ.

Контроль присутствия различных примесей

График зависимости оптической плотности от длины волны излучения имеет характерную для каждого вещества форму. Этот график сравнивают по форме с эталонными графиками, представленными в литературе, и делают выводы о наличии или отсутствии примесей. Концентрацию веществ устанавливают по относительной оптической плотности, то есть по «высоте» так называемых пиков.

ИК-спектроскопия позволяет с высокой точностью определять количество примесей, но только в случаях относительно небольших количеств отдельных примесей. Сильно загрязненные пробы воды, содержащие до десяти различных органических веществ, достаточно легко поддаются анализу и интерпретации, в то время как пробы природной воды, содержащие сотни, а иногда и тысячи различных видов примесей, дают малоинформативный сигнал и «грязные». ИК-анализ, как правило, является более глубоким методом, чем спектрофотометрия, и дает более точные результаты, но также требует большей подготовки как исследователя, так и образцов.

Расчет результата

Современные приборы автоматически рассчитывают все необходимые исследователю параметры и выдают спектрограммы, готовые для прочтения и интерпретации исследователем. Старые инструменты могут потребовать от исследователя дополнительных расчетов. Это вносит некоторую вероятность человеческой ошибки, поэтому для работы предпочтительнее использовать более современное оборудование. Однако спектрограммы образцов, содержащих более одного аналита, требуют правильного считывания, что также предъявляет значительные требования к квалификации оператора оборудования.

Оптимальный итог

Современные спектрофотометры выполняют расчеты по результатам анализа в автоматическом режиме и учитывают различные процессы, происходящие в исследуемом веществе. Примером такого взаимодействия, которое учитывает прибор, является «сито-эффект» — способность частиц испытуемого вещества в высокой концентрации фильтровать другие частицы в испытуемом растворе и, как следствие, изменять свойства пробы оптика Для учета и противодействия такому взаимодействию частиц современные приборы позволяют определять избыточную концентрацию в исследуемом образце по косвенным сигналам и предупреждать исследователя о возможных ошибках измерения.

Суммарная оптическая плотность испытуемого вещества и его спектрограмма могут быть построены по данным, полученным непосредственно с детектора. В этом случае следует говорить об обычном значении оптической плотности. Кроме того, существует понятие относительной оптической плотности.

Относительный (с выявлением ошибок)

Относительная оптическая плотность – это значение х, равное отношению оптической плотности испытуемого вещества к оптической плотности контрольного раствора. Метод, требующий холостых растворов, часто используется в тех случаях, когда оптические характеристики испытуемого вещества показывают отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера, а также когда в распоряжении исследователя имеются более старые приборы.

Как и во всех других методах анализа, в спектрофотометрии приветствуется многократное измерение свойств образца с последующей их математической обработкой.

Так, на территории России и СНГ большая часть учебно-лабораторных работ по спектрофотометрии требует от студентов не менее трехкратного измерения оптической плотности образца, а затем усреднения полученных показателей. Такой подход позволяет учесть погрешности и неточности метода, к которым относятся различные физические взаимодействия частиц исследуемого вещества, такие как «решетчатый эффект» и другие.

Преимущества, достоинства и недостатки спектрофотометров

Спектрофотометры являются исключительно чувствительными приборами, способными обнаруживать следовые количества различных веществ. Их можно использовать во многих отраслях техники, в том числе в системах безопасности аэропортов. Интересно, что в некоторых аэропортах мира (особенно часто в Израиле) сотрудники службы безопасности берут пробы из багажа пассажиров и затем подвергают их анализу, в том числе спектрофотометрическому. Это позволяет обнаруживать как следы контакта с ВВ, так и непосредственно ВВ.

Высокая чувствительность приборов накладывает определенные ограничения на их работу, ведь малейшие примеси будут влиять на точность и «чистоту» аналитических данных.

Однако главными достоинствами таких приборов следует считать высокую чувствительность и селективность анализов, а также возможность работы с жидкими и твердыми образцами, их сравнительную простоту, надежность, долговечность и относительную дешевизну.

Основными недостатками спектрофотометрии являются подверженность влиянию примесей на точность анализа, невозможность анализа веществ, для которых отсутствуют литературные данные (спектры поглощения не установлены), достаточно высокие требования к квалификации оператора в случай примесей и нестандартных загрязнений, так как их определение может быть затруднено, а также относительно медленная пробоподготовка при работе с прибором.

Спектрофотометры, как и многие другие приборы для химического анализа, имеют свою нишу применения благодаря совокупности свойств. Без них невозможно представить современные биохимические и фармакологические производства и лаборатории, а также металлургические предприятия. Достоинства спектрофотометрии часто перевешивают ее недостатки, что определяет популярность и распространенность этого метода анализа.